| ชื่ออาจารย์ที่ปรึกษา |
Gerd Katzenmeier, Ph.D.Albert ketterman, Ph.D.ชนันท์ อังศุธนสมบัติ, Ph.D.ชาติชาย กฤตนัย, Ph.D.ปนัดดา บุญเสริม, Ph.D.
Gerd Katzenmeier, Ph.D.Albert Ketterman, Ph.D.Chanan Angsuthanasombat, Ph.D.Chartchai Krittanai, Ph.D.Panadda Boonserm, Ph.D. |
| บทคัดย่อ(ไทย) |
โปรตีเอส NS3 ของเชื้อไวรัส dengue เป็นส่วนที่จำเป็นต่อการขยายพันธุ์ของเชื้อไวรัสและเป็นเป้าหมายหลักสำคัญสำหรับการออกแบบยาต่อต้านไวรัสชนิดนี้ จุดประสงค์ของงานวิจัยนี้คือ เพื่อศึกษาถึงบทบาทหน้าที่ของกรดอะมิโนบางตัวของโปรตีน NS2B ในการเร่งปฏิกิริยาของโปรตีเอสและเพื่อสืบหาความจำเพาะเจาะจงต่อสารตั้งต้นของเอนไซม์โปรตีเอสคอมเพลกซ์ NS2B-NS3 จากการตรวจสอบถึงผลกระทบของการแทนที่ด้วย alanine ในส่วนของโปรตีน NS2B ณ ที่ตำแหน่ง Trp62, Ser71, Leu75, Ile77, Thr78 และ Ile79 โดยศึกษาในหลอดทดลองพบว่าความสามารถในการตัดตัวเองของโปรตีนกลายพันธุ์ L75A, I77A และ I79A แย่ลงเมื่อเทียบกับโปรตีนต้นแบบส่วนโปรตีนกลายพันธุ์ W62A และ L75A/I79A นั้นสูญเสียความสามารถในการตัดตัวเองเกือบทั้งหมด ค่าคงที่ทางจลศาสตร์ซึ่งวัดจากการย่อยสารตั้งต้น GRR-AMC บ่งชี้ว่าโปรตีนกลายพันธุ์มีความสามารถในการย่อยสารตั้งต้นลดลงโดยแสดงให้เห็นว่าค่า ~ik~icat นั้นลดลงอย่างมากยกเว้นโปรตีนกลายพันธุ์ S71A ซึ่งมีค่าประสิทธิภาพการเร่งปฏิกิริยา ~ik~icat/~ik~im ใกล้เคียงกับโปรตีนต้นแบบ นอกจากนี้ได้ศึกษาความจำเพาะเจาะจงต่อสารตั้งต้นโดยใช้เปปไทด์สังเคราะห์ (quenched synthetic peptide) ที่ติดฉลากด้วยตัวเรืองแสง ~io~i-aminobenzoic acid และตัวดูดซับแสง 3-nitro-L-tyrosine พบว่าการลดขนาดของเปปไทด์ต้นแบบที่มีลำดับกรดอะมิโนจากตำแหน่ง NS3/NS4A ทำให้ทราบขนาดของสารตั้งต้นที่พอเหมาะซึ่งเป็นเปปไทด์ที่มีกรดอะมิโนเจ็ดตัวบนตำแหน่ง P4-P3' เมื่อได้ศึกษาปฏิกิริยาต่อสารตั้งต้นลูกผสมซึ่งถูกออกแบบโดยการรวมลำดับกรดอะมิโนเข้าด้วยกันจากตำแหน่งทั้งห้าที่เกิดขึ้นตามธรรมชาติทั้งจากด้าน nonprime และ primeได้เผยให้เห็นถึงอิทธิพลของด้าน nonprime ที่มีต่อแรงจับตัว (binding affinity) ของสารตั้งต้นต่อเอนไซม์ในขณะที่ลำดับกรดอะมิโนของด้าน prime นั้นมีผลกระทบต่ออัตราเร็วในการตัด (turnover rate) แลพบว่าสารตั้งต้นที่ดีที่สุดนั้นเป็นลูกผสมของตำแหน่ง capsid-NS3/NS4A (Abz-RRRR-SLTL-Y(NO2)-NH2)โดยมีค่าประสิทธิภาพการเร่งปฏิกิริยา ~ik~icat/~ik~im เท่ากับ 10,868 M-1sec-1 ซึ่งมากกว่าเปปไทด์ที่แย่ที่สุดซึ่งเป็นลูกผสมของตำแหน่ง NS3-NS5(Abz-AGRK-GTGN-Y(NO2)-NH2) ถึง 547 เท่า นอกจากนี้ที่ตำแหน่ง P1' นั้นเอนไซม์มีความชอบต่อกรดอะมิโน serine มากกว่า glycine และ alanine และยังพบว่าค่าประสิทธิภาพการย่อยสารตั้งต้นสามารถเรียงลำดับได้เป็น ตำแหน่ง capsid >> NS2B/NS3 > NS2A/NS2B > NS3/NS4A > NS4B/NS5 จึงสรุปได้ว่าข้อมูลที่ได้จากการศึกษานี้เป็นการค้นพบความชอบจำเพาะของสารตั้งต้นของโปรตีเอส NS3 ซึ่งจะมีประโยชน์ในการออกแบบตัวยับยั้งโปรตีน NS3 โดยการใช้ข้อมูลทางโครงสร้างของสารตั้งต้นดังกล่าว |
| บทคัดย่อ(English) |
Dengue virus NS3 protease is essential for viral replication and is considered a prime target for anti-viraldrug design. This research aimed to characterize a functional role of selected NS2B residues for protease activation,and to explore the substrate specificity of the NS2B-NS3 protease complex. The effect of alanine substitutionsof selected residues within NS2B, Trp62, Ser71, Leu75, Ile77, Thr78 and Ile79 were investigated. ~iIn vitro~iautoproteolytic cleavage analysis revealed that the L75A, I77A and I79A mutants were defective in autoproteolysiscompared to the wild-type. The W62A and the L75A/I79A mutants had almost completely abolished autocleavageactivity. Kinetic constants obtained with GRR-AMC substrate indicate that mutant enzymes had a reduced catalyticactivity, demonstrated by predominantly reduced kcat values, except for S71A which hada ~ik~icat/~ik~im value similar to that of the wild-type. Substrate specificity of the enzyme was explored by using quenched synthetic peptides incorporated withthe ~io~i-aminobenzoic acid/3-nitro-L-tyrosine fluorescence donor-quencher pair. Truncation studies basedon the NS3/NS4A cleavage sequence peptides led to the identification of an optimal substrate size, a heptapeptidespanning P4-P3' positions. Chimeric substrates, designed by swapping the nonprime-prime residues (P4-P4') derivedfrom five natural cleavage sequences, revealed a significant in fluence of the nonprime side residues on bindingaffinity, whereas sequences at the prime side region had greater effect on the turnover rate. The best substrateobtained was a hybrid of capsid-NS3/NS4A, Abz-RRRR-SLTL-Y(NO2)-NH2 witha ~ik~icat/~ik~im of 10,868 M-1 s-1, which is 547-foldhigher than the poorest substrate Abz-AGRK-GTGN-Y(NO2)-NH2, a hybrid ofNS3-NS5. At the P1', enzyme prefers serine > glycine >> alanine. The ranking order of the hydrolytic efficienciescan be given as capsid >> NS2B/NS3 > NS2A/NS2B > NS3/NS4A > NS4B/NS5. These results conclusivelyconfirmed and established the substrate preferences of the dengue virus NS3 protease, and offered valuableinformation for the structure based design of anti-NS3 inhibitors. |
