| รายละเอียดวิทยานิพนธ์ | |
| ชื่อวิทยานิพนธ์ | การศึกษาคุณสมบัติทางอณูชีววิทยาและชีวเคมีของเอนไซม์ membrane-bound fatty acid desaturase : (+,D)9 และ (+,w)3 Molecular and biochemical characterization of membrane-bound fatty acid desaturases : (+,D)9 and (+,w)3 desaturases |
| ชื่อนิสิต | เดือนเพ็ญ มีทรัพย์ยอดสุข Dauenpen Meesapyodsuk |
| ชื่ออาจารย์ที่ปรึกษา | ดร สุภาภรณ์ ชีวะธนรักษ์ ดร พัชราภรณ์ เดชเนียม Dr patrick Covello Dr Supapon Cheevadhanarak Dr Patcharaporn Deshnium Dr Patrick Covello |
| ชื่อสถาบัน | มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีพระจอมเกล้าธนบุรี. บัณฑิตวิทยาลัย King Mongkuts University of Technology Thonburi. Bangkok (Thailand). Graduate School. |
| ระดับปริญญาและรายละเอียดสาขาวิชา | วิทยานิพนธ์ดุษฎีบัณฑิต. วิทยาศาสตร์ (เทคโนโลยีชีวภาพ) Ph.D. Science (Biotechnology) |
| ปีที่จบการศึกษา | 2544 |
| บทคัดย่อ(ไทย) | วิทยานิพนธ์นี้ได้ทำการศึกษาคุณสมบัติทางอณูชีววิทยาและชีวเคมีของเอนไซม์ membrane-bound desaturase 2 กลุ่ม คือ กลุ่ม (+,w) -x และ (+,D) -x ซึ่งเน้น ถึงความสัมพันธ์ระหว่างโครงสร้างและหน้าที่ของเอนไซม์ทั้ง 2 กลุ่ม โดยได้ศึกษา คุณสมบัติของเอนไซม์ (+,w) 3 desaturase จากพืช ~iCamelina sativa~i จากสัตว์ ~iCaenorhabditis elegans~i และ (+,D) 9 desaturase จาก ~iSpirulina platensis C(,1) ได้ทำการโคลน cDNAs ของ ~ifad7~i และ ~ifad3~i จาก ~iC. Sativa~i และวิเคราะห์ลำดับ กรดอะมิโนจากยีนที่โคลนได้ พบว่า ยีนทั้งสองเป็นยีนที่สังเคราะห์เอนไซม์ (+,w) 3 desaturase และมีโครงสร้างอยู่ในเมมเบรนของ chloroplast และ ของ endoplasmic reticulum ตามลำดับ และเพื่อเป็นการเปรียบเทียบการทำงานของเอนไซม์ (+,w) 3 desaturase จากพืชและสัตว์จึงได้ทำการศึกษาคุณสมบัติทางชีวเคมีของ ~ifad7~i และ ~ifad3~i จาก ~iC. Sativa~i และ ~ifat1~i จาก ~iC. Elegans~i (ที่โคลนโดย Spychalla และคณะ [1]) จากผลการศึกษาความจำเพาะต่อ substrate พบว่าเอนไซม์ที่ได้ จากทั้ง 2 แหล่งให้ผลไปในทำนองเดียวกันคือ สามารถเติมพันธะคู่ให้กับกรดไขมันที่ มีความยาว 16 ถึง 20 คาร์บอน และผลจากการศึกษาความจำเพาะต่อบริเวณที่เกิด ปฏิกิริยา พบว่าเอนไซม์นี้มี strong activity กับกรดไขมันในกลุ่ม (+,w) 6 ซึ่ง ยืนยันว่าเอนไซม์ทั้ง 2 แหล่ง เป็นเอนไซม์ (+,w) 3 desaturase การศึกษานี้เป็น รายงานแรกที่พบว่าตำแหน่งแรกของการเกิดออกซิเดชันของเอนไซม์ ในกลุ่ม (+,w) -x desaturase เกิดขึ้นที่ตำแหน่งคาร์บอนที่อยู่ใกล้กับปลายคาร์บอกซิลของกรดไขมัน สำหรับการศึกษาในกลุ่ม (+,D)-x ได้โคลนยีน ~idesCi~ จาก ~iS. Platensis~i C(,1) ยีนนี้ทำหน้าที่เติมพันธะคู่ให้กับกรดไขมันที่ตำแหน่งคาร์บอนที่ 9 นับจาก ปลายคาร์บอกซิล โดยลำดับกรดอะมิโนที่ได้จากการถอดรหัสมีความคล้ายคลึงกับลำดับ กรดอะมิโนของเอนไซม์ (+,D) 9 desaturase จากสิ่งมีชีวิตอื่น ๆ และเมื่อตรวจสอบ หน้าที่ของยีนนี้ในยีสต์ที่บกพร่องในการทำงานของเอนไซม์นี้ พบว่ามี strong activity กับ stearic acid มากกว่า palmitic acid และตำแหน่งแรกของการเกิดออกซิเดชัน เป็นตำแหน่งคาร์บอนที่อยู่ใกล้กับปลายคาร์บอกซิลซึ่งเหมือนกับการทำงานของ เอนไซม์ในกลุ่ม (+,w)-x โดยสรุปจากการวิเคราะห์เอนไซม์ membrane bound desaturase ทั้ง 2 กลุ่มพบว่ามีความคล้ายกันในระดับกรดอะมิโน ลักษณะของ hydropathy profile และบริเวณที่คาดว่าเป็นตำแหน่งที่จับกับ diiron รวมถึงตำแหน่งแรกของการเกิด ออกซิเดชัน จากคุณสมบัติทั้งหมดนี้สามารถสนับสนุนได้ว่าเอนไซม์ทั้ง 2 กลุ่ม น่า จะอยู่ใน topology family เดียวกัน |
| บทคัดย่อ(English) | To elucidate the insight structure/function relationships of (+,w)-x and (+,D)-x membrane bound desaturases, two (+,w)3 desaturases from ~iCamelina sativa~i (plant) and one (+,w)3 desaturase from ~iCaenorhabditis elegans~i (animal) and a (+,D)9 desaturase from ~iSpirulina platensis~i C(,1) were studied. The ~ifad7~i and ~ifad3~i cDNAs encoding (+,w)3 desaturases were isolated from ~iC. sativa~i by RT-PCR. The amino acid sequence analysis revealed that Fad7 and Fad3 might localize in the membrane of chloroplast and of endoplasmic reticulum, respectively. Analysis of the substrate specificity of ~ifad7~i and ~ifad3~i from ~iC. sativa~i and ~ifat1~i from ~iC. elegans~i (cloned by Spychalla, et. al. [1]) indicated that (+,w)3 desaturases from these plant and animal act on substrates of 16-20 carbons with a preference for (+,w)6 fatty acids and their regioselectivities strongly confirmed to be (+,w) desaturase. In addition, the primary kinetic isotope effect (KIE) was examined using FAT1 as the representative. The result strongly suggests that the site of initial oxidation (cryptoregiochemistry) for (+,w)3 desaturation is at C-15, not at C-16. This study presents the first KIE determinations for a desaturase that measure from the methyl end of the substrate. The ~idesC~i gene encoding (+,D)9 desaturase, a (+,D)-x desaturase, was cloned from ~iS. platensis~i C(,1). Its deduced amino acid sequence exhibits high homology with the cloned (+,D)9 desaturases from other organisms. Function of this enzyme was confirmed by complementation with a mutant yeast lacking (+,D)9 desaturase activity. Analysis of the enzyme activity indicated that this enzyme had a substrate preference for stearic acid (18:0) rather than palmitic acid (16:0). To compare the cryptoregiochemistry between (+,D) and (+,w) desaturase, KIE for ~iS. platensis~i (+,D)9 desaturase was also determined. A large KIE was found for the 9 position and a small inverse effect was found for the 10 position. Interestingly, despite the difference in regioselectivity of (+,w)-x and (+,D)-x, the site of the first C-H cleavage at the carbon closer to the carboxyl terminus of both types were similar. The similarity of membrane-bound desaturases analyzed in terms of primary structure, hydropathy profile, putative diiron binding site as well as cryptoregiochemistry strongly supports the notion that these enzymes belong to one topological family. |
| ภาษาที่ใช้เขียนวิทยานิพนธ์ | |
| จำนวนหน้าของวิทยานิพนธ์ | |
| ISBN | |
| สถานที่จัดเก็บวิทยานิพนธ์ | |
| คำสำคัญ | ~iSpirulina platensis~i, ~iCaenorhabditis elegans~i, ~iCamelina sativa~i, (+,D) 9 DESATURASE, (+,w)3 DESATURASE, SUBSTRATE SPECIFICITY, REGIOSPECIFICITY, CRYPTOREGIOCHEMISTRY, ~iSpirulina platensis~i, ~iCaenorhabditis elegans~i, ~iCamelina sativa~i, (+,D) 9 desaturase, (+,w) 3 desaturase, ความจำเพาะต่ออาหาร, ความจำเพาะ ต่อบริเวณ, ตำแหน่งแรกของการเกิดออกซิเดชัน |
| วิทยานิพนธ์ที่เกี่ยวข้อง |
|
