| รายละเอียดวิทยานิพนธ์ | |
| ชื่อวิทยานิพนธ์ | การแยกและวิเคราะห์ cDNA ของไซโตโครม พี 450 จากยุงก้นปล่อง ~iANOPHELES MINIMUS~i ISOLATION OF A CYTOCHROME P450 cDNA FROM ~iANOPHELES MINIMUS~i |
| ชื่อนิสิต | เนาวรัตน์ ถนอมสิงห์ Naowarat Tanomsing |
| ชื่ออาจารย์ที่ปรึกษา | อ พรพิมล รงค์นพรัตน์ Ph D อ ประพนธ์ วิไลรัตน์ Ph D อ มธุรส พงษ์ลิขิตมงคล Ph D Pornpimol Rongnoparut Ph D Prapon Wilairat Ph D Mathurose Ponglikitmongkol Ph D |
| ชื่อสถาบัน | มหาวิทยาลัยมหิดล. บัณฑิตวิทยาลัย Mahidol Univerisity. Bangkok. (Thailand). Graduate School. |
| ระดับปริญญาและรายละเอียดสาขาวิชา | วิทยานิพนธ์มหาบัณฑิต. วิทยาศาสตร์ (ชีวเคมี) Master. Science (Biochemistry) |
| ปีที่จบการศึกษา | 2545 |
| บทคัดย่อ(ไทย) | ไซโตโครม พี450 เป็นกลุ่มของเอ็นไซม์ซึ่งทำหน้าที่ในกระบวนการเมตาบอลิซึม ของสารในร่างกายและสารแปลกปลอมภายนอกที่เข้าสู่ร่างกาย เอ็นไซม์ พี 450 ในกลุ่ม แฟมิลีที่ 6 นับเป็นกลุ่มสำคัญที่มีรายงานถึงความสัมพันธ์กับการดื้อสารฆ่าแมลงหลาย ชนิด เช่น การดื้อต่อสารไพรีทรอยด์ที่มีรายงานในแมลงวันบ้าน ~i(Musca domestica)~i และหนอนเจาะสมอฝ้าย ~i(Helicoverpa armigera)~i ปัจจุบันสารไพรีทรอยด์ถูก ใช้ในการควบคุมพาหะ ยุงก้นปล่อง ~i(Anopheles minimus)~i แต่การใช้สารไพรีทรอยด์ ในระยะยาวอาจกระตุ้นให้ยุงมีการเพิ่มระดับการแสดงออกของยีน พี 450 และพัฒนาสู่ การดื้อต่อสารนี้ได้ การศึกษานี้จึงแยก cDNA ของไซโตโครม พี 450 จากยุงก้นปล่อง และเปรียบเทียบระดับการแสดงออกของ mRNA ระหว่างยุงกลุ่มที่ดื้อสารไพรีทรอยด์และ ยุงที่ไม่เคยได้รับสารนี้มาก่อน การสกัดไซโตโครม พี 450 แฟมิลีที่ 6 ~i(CYP6)~i จากยุงก้นปล่อง ทำได้โดย แยกชิ้นส่วนของยีน ~iCYP6~i จากยุงก้นปล่องโดยใช้ไพรเมอร์ที่ออกแบบจากบริเวณที่ มีความเหมือนกัน (Conserved regions) ของยีน ~iCYP6~i ที่มีรายงานในแมลง ชนิดอื่น บริเวณที่เป็นต้นแบบในการสังเคราะห์ไพรเมอร์คือ DVIGSCAF และ ETLR motif หลังจากได้ชิ้นส่วนของยีน ~iCYP6~i แล้ว ไพรเมอร์ที่จำเพาะกับชิ้นส่วนนี้ได้สร้างขึ้น เพื่อขยายบริเวณไปสู่จุดเริ่มต้นและสิ้นสุดของการแปลรหัส และเมื่อได้ชิ้นส่วนครอบคลุม จากจุดเริ่มต้นและสิ้นสุดของ ~iCYP6~i แล้ว ไพรเมอร์จำเพาะในบริเวณส่วนต้น และท้ายได้ออกแบบเพื่อสกัด cDNA ของ ~iCYP6~i ที่ครอบคลุมบริเวณจากจุดเริ่มต้น แล้วสิ้นสุดของการแปลรหัส การเปรียบเทียบลำดับกรดอะมิโนของ ~iCYP6~i ที่แยก ได้กับ ~iCYP6~i ในแมลงอื่นๆ พบ Conserved regions ซึ่งมีลักษณะเหมือน ~iCYP6~i ทั่วไป และมีความเหมือนกับ ~iCYP6S1~i ของยุงก้นปล่อง ~iAn. gambiae~i มาก ที่สุดคือ 82% เราจึงสามารถตั้งชื่อ cDNA ที่สกัดได้ตามหลักการจัดจำแนกของ พี 450 ว่า ~iCYP6S2~i การเปรียบเทียบการแสดงออกของ ~iCYP6S2~i ระหว่างยุงที่ดื้อสารไพรีทอยด์ และยุงที่ไม่ได้รับสารไพรีทอยด์ไม่พบความแตกต่างในระดับ transcription ของยุง ทั้ง 2 กลุ่ม โดยสามารถสรุปว่ายีน ~iCYP6S2~I ไม่สามารถถูกเหนี่ยวนำให้เพิ่มการ แสดงออกในยุงก้นปล่อง ~iAn. minimus~i ด้วยสารไพรีทรอยด์ |
| บทคัดย่อ(English) | Cytochrome P450 monooxygenases comprise important enzymes which play a role in insecticide resistance in insects. Increased expression of ~iCYP6~i genes is responsible for insecticide resistance in various insects. ~iAnopheles minimus~i is a major malaria vector in Thailand. To control the vector, synthetic pyrethroids have been used. However, pyrethroid resistance is reported in some insects including ~iMusca domestica~i and ~iHelicoverpa armigera~i. Long-term use of pyrethroids could also induce pyrethroid resistance in mosquitoes. The aim of the thesis was to isolate and to determine whether the isolated ~iCYP6~i was associated with pyrethroid resistance. The complete coding CYP6S2 cDNA was isolated from ~iAn.minimus~i. A fragment of ~iCYP6~i genomic DNA was first isolated using degenerated oligonucleotide primers based on amino acid sequences of two conserved regions, DVIGSCAF and ETLR motif of other insect ~iCYP6~i genes. ~iCYP6~i DNA fragment had a size of approximately 600 bp. ~iCYP6~i DNA fragment was cloned, sequenced and translated into deduced amino acids. Alignment of amino acids deduced from the partial ~iCYP6~i fragment with those of other insect ~iCYP6s~i showed homology of similar conserved amino acids. Thus the fragment belonged to family 6 and gene specific oligonucleotide primers which were designed to extend the partial ~iCYP6~i sequence towards 5 upstream and 3 downstream regions using genomic DNA walking and 3 RACE technique, respectively. The extended sequences encompassed the translation start and stop sites. Specific oligonucleotide primers containing sequences encompassing translation start and stop sites were then designed in order to obtain the complete coding CYP6S2 cDNA. The CYP6S2 cDNA with 1.5 kb in length was obtained and translated into deduced amino acids. Comparison between genomic DNA and cDNA sequences showed one 60 by intron residing in front of the ETLR motif. Deduced amino acids of CPAN2 were aligned with other insect ~iCYP6~i genes and showed highest percent homology (82%) with an unpublished ~iCYP6S1~i from ~iAn. gambiae~i. CPAN2 was subsequently designated ~iCYP6S2~i. Semi-quantitative RT-PCR was performed in order to compare the expression of ~iCYP6S2~i gene between the pyrethroid resistant (20% resistant) and susceptible strains of ~iAn. minimus~i. There was a similar level of CYP6S2 mRNA expressed between the pyrethroid resistant and susceptible strains. |
| ภาษาที่ใช้เขียนวิทยานิพนธ์ | 974-04-1929-1 |
| จำนวนหน้าของวิทยานิพนธ์ | |
| ISBN | 98 P. |
| สถานที่จัดเก็บวิทยานิพนธ์ | |
| คำสำคัญ | CYTOCHROME P450 MONOOXYGENASE, ~iANOPHELES MINIMUS~i, SEMI-QUANTITATIVE RT-PCR |
| วิทยานิพนธ์ที่เกี่ยวข้อง |
|
